DNA 서열결정(국문) DNA sequencing(영문)

DNA 서열결정 방법

1950년대에 왓슨(Watson)과 크릭(Crick)은 양 가닥의 DNA 내 뉴클레오티드의 방향성이 서로 반대이고 각 염기에 대해 상보적(티민은 아데닌, 구아닌은 시토신과 항상 쌍을 이룸)이며 서로 수소결합을 이루는 이중 나선 구조임을 밝혔다. 이러한 DNA 이중나선 구조의 상보적 동일성은 세대간 유전시 동일한 유전자 전달의 바탕이 된다. DNA를 구성하는 염기서열을 확인하는 방법으로 맥삼 길버트(Maxam Gilbert) 시퀀싱법과 생어(Sanger) 시퀀싱법이 있습니다

DNA 서열결정(DNA 시퀀싱; DNA sequencing)은 DNA 분자 내 뉴클레오티드의 정확한 배열순서를 확인하는 데 이용되는 방법을 말한다. DNA 서열결정은 DNA 가닥을 구성하는 4가지 염기(티민(T), 아데닌(A), 시토신(C), 그리고 구아닌(G))의 배열순서를 결정함으로 DNA 염기서열의 정보를 알 수 있게 해 줍니다

Maxam Gilbert 시퀀싱

1977년도에 알란 맥삼(Alan Maxam)과 월터 길버트(Walter Gilbert)에 의해 DNA 염기서열을 결정하는 방법이 개발되었다. 이 방법은 화학적인 방법으로 DNA 염기 특이적으로 변형시켜 변형된 염기 인접한 위치의 DNA 골격의 절단이 일어나는 원리에 기초를 두고 있다. 간략히 설명하면, DNA가닥의 5‘ 말단을 32P로 표지를 하고 열을 가하여 단일 가닥으로 분리하여, 각 가닥의 4가지 종류 염기에 특이적으로 작용하는 특정 시약을 처리한다. 각각으로 얻어지는 단편들을 고해상도 폴리아크릴 아마이드 젤로 전기영동하고 자가 방사선 기법으로 엑스선 필름에 감광한다. 단편들의 크기에 의해 순서가 정해지며 DNA 분자의 염기서열을 유추하게 하는 방법입니다

특정 시약으로 디메틸 설페이트(Dimethyl sulphate)는 퓨린계 염기(아데닌과 구아닌)를 공격하고 히드라진(Hydrazine)은 피리미딘계 염기(시토신과 티민)를 공격하여 오탄당과 염기의 글리코시딕 결합이 절단되어 탈리 된다 (그림 1). 이때 디메틸 설페이트가 개미산 또는 포름산(formic acid)에 녹여져 있으면 아데닌과 구아닌 모두에 반응하지만 단독으로는 구아닌에만 반응한다. 반면에 히드라진 단독으로는 시토신과 티민 모두에 반응하지만 염화나트륨 용액(2M)에 녹여져 있을 때는 시토신에만 반응한다. 이처럼 처리 조건에 따라 구아닌(G), 구아닌과 아데닌(G+A), 시토신과 티민(C+T), 그리고 시토신(C)에 반응하는 샘플들로 나눌 수 있다. 한편, 피페르딘(Piperdin)이라는 시약은 염기가 탈리된 지점의 포스포에스테르(phosphodiester) 결합을 절단함으로 남아 있는 오탄당을 제거한다 (그림 1). 이와 같이 얻어진 샘플들을 전기 영동하여 필름에 감광하면 크기가 적은 순서로부터 DNA 서열을 정확히 알아낼 수 있습니다

DNA 서열결정의 응용 분야

DNA 서열결정은 의학 진단, 법의학, 생물공학등 기본적 생물학 연구에 기초를 제공한다. 차세대 염기서열 분석(Next generation sequencing)과 같이 현대의 진보된 DNA 시퀀싱 기술은 많은 동식물, 미생물, 그리고 사람에 대한 전체 유전자에 대한 정확한 배열순서를 제공해 준다. 또한 유전체에 대한 정보와 이를 이용한 단백질 합성 정보, 유전자 변이 여부, 유전자 표현형과 질병과의 관계, 그리고 잠재적 약물치료의 표적을 설정하는데도 이용될 수 있습니다

Sanger 시퀀싱

1977년도에 프레데릭 생어(Frederick Sanger)와 동료에 의해 개발된 방법으로 DNA 복제 과정 중 DNA 사슬을 마치는 디디옥시뉴클레오티드(dideoxynucleotide)가 병합되면 합성종결(사슬 종결; chain-termination)이 일어나는 점에 착안하여 개발되었고 현재 많은 시퀀싱방법의 토대가 되었죠

고전적인 생어 시퀀싱 법은 하나의 단일 나성 DNA 주형, DNA 프라이머(시발체; primer), 디옥시뉴클레오시드3인산염(dNTPs; deoxynucleosidetriphosphates), 수정된 디-디옥시뉴클레오시드3인산염(ddNTPs; dideoxynucleotidetriphosphates), 그리고 DNA 중합효소를 조건에 맞게 반응시킨다. DNA 샘플은 4가지로 분리된 시퀀싱 반응을 위해 4가지의 표준 디옥시뉴클레오티드(dATP, dGTP, dCTP, dTTP)와 DNA 중합효소를 포함시킨 조건에서 각각 반응시킨다. 이때 각 반응에 ddNTP 즉 ddCTP, ddATP, ddGTP, 그리고 ddTTP 중 하나를 dNTP의 농도에 100배 정도 낮게 준비하여 각각의 실험관에 첨가한다 (그림 2). DNA 신장 반응시, ddNTP가 삽입되면 두 뉴클레오티드의 결합을 형성하는데 필요한 3‘-OH기가 ddNTP는 존재하지 않기 때문에 더 이상 DNA사슬을 신장시킬 수 없고 반응이 종결된다. 이 ddNTPs는 방사성 동위원소 32P 또는 형광물질을 표지함으로써 전기영동후 필름에 감광하여 분석하거나 자동화된 시퀀싱기계로 정확한 염기서열을 판독할 수 있다고 봅니다

어두운 환경에 있는 사람의 동공에 빛을 쪼이면 동공의 크기가 줄어드는 현상을 관찰할 수 있는데, 이를 빛반사(light reflex), 동공반사(pupil reflex), 또는 동공빛반사(pupillary light reflex)라고 한다. 빛반사는 한쪽 눈에만 강한 광선을 주는 경우에도 양쪽 눈에서 동시에 나타난다. 이 때 빛을 준 쪽 눈에서 나타나는 반사를 직접동공반사(direct pupil reflex), 반대 쪽 눈에서 나타나는 반사를 간접동공반사(consensual pupil reflex)라고 합니다

동공 크기 조절 기전

홍채(iris)의 가운데 있는 구멍을 동공(눈동자)이라고 부르며, 그 크기에 따라 망막에 전달되는 빛의 양이 달라진다. 우리 눈은 주변의 밝기에 따라 동공의 크기를 조절하여 망막에 도달하는 빛의 양을 조절할 수 있습니다

동공 크기의 조절은 홍채의 조리개근(sphincter muscle)과 확대근(dilator muscle)을 수축 또는 이완시킴으로써 가능하다.조리개근은 홍채에 동심원을 이루는 고리 모양의 근육으로 수축하면 동공의 크기가 작아지고 이완하면 동공의 크기가 커진다. 한편, 확대근은 동공 주변에 방사상으로 존재하여 수축하면 동공의 크기가 커지고 이완하면 동공의 크기가 작아집니다

조리개근은 부교감신경의 지배를 받고 확대근은 교감신경의 지배를 받으므로, 부교감신경의 흥분이 강할 때에는 동공의 크기가 작아지고 교감신경의 흥분이 강할 때에는 동공의 크기가 커집니다

동공의 크기는 빛의 밝기에 의해 조절되는데, 이외에도 가까이 있는 물체를 볼 때에는 작아지고(near sight accomodation), 멀리 있는 물체를 볼 때에는 커진다(far sight accomodation). 또, 니코틴 등의 약물에 의해서도 크기가 변한기도합니다